Nel dicembre 2017 l’Università di Trento ha depositato una domanda di brevetto che riguarda l’invenzione di una nuova procedura rapida, efficiente e poco costosa per l’isolamento di vescicole extracellulari da fluidi biologici, tra cui sangue, urina, saliva. Il brevetto nasce da uno studio interdisciplinare condotto al CIBIO su temi di frontiera riguardo all’applicazione delle nanoparticelle in ambito biomedico. L’invenzione è stata sviluppata nel Laboratory of Biotechnology and Nanomedicine insieme al Laboratory of Translational Genomics (Principal Investigator Alessandro Quattrone) e al Laboratory of Genomic Screening (Principal Investigator Alessandro Provenzani).
La procedura, ideata partendo dallo studio delle nanoparticelle secrete dalle cellule sia in stato fisiologico che di malattia, presenta numerosi vantaggi tra i quali la purificazione di nanoparticelle integre, preservando dispersità originale e stabilità, e l’integrazione con sistemi ultrasensibili per il rilevamento di biomarcatori specifici di malattia (proteine e acidi nucleici).
L’invenzione di questo brevetto si basa su un principio innovativo che viene sfruttato per l’isolamento delle vescicole extracellulari (EV). Le EV sono particelle sferiche secrete dalle cellule e costituite da una doppia membrana lipidica, così come le membrane di una cellula. Le EV sono abbondantemente rilasciate nei fluidi biologici e le loro dimensioni sono molto variabili: esse infatti vengono distinte principalmente in esosomi (vescicole molto piccole) e microvescicole (vescicole più grandi), ma con un diametro in entrambi i casi misurato nell’ordine dei nanometri (un miliardesimo di metro) e che quindi risulta anche 100-1000 volte più piccolo di quello di una cellula.
La comunità scientifica avvalora le EV come nuovo promettente strumento diagnostico da biopsia liquida (sangue, urina saliva, ecc…) per rilevare con altissima risoluzione e in stadi precocissimi le prime tracce della malattia. La ricerca su EV e la loro applicazione è stata però limitata finora a causa di procedure di isolamento dispendiose, che non consentivano una purificazione priva di altri “contaminanti biologici” abbondanti, quali proteine e loro complessi con acidi nucleici che risultano avere dimensioni molto simili e generano irriproducibilità dei test. Aspetti negativi ai quali cerca di ovviare il metodo da noi inventato.
L’idea alla base di questo nuovo metodo è molto semplice: così come le cellule delimitate da una membrana lipidica mostrano una differenza di potenziale superficiale (presenza di cariche), le EV sono caratterizzate da una carica netta negativa. La fisica insegna che questo potenziale fluttua in funzione del pH, della temperatura e dei sali disciolti nei vari fluidi. Tuttavia, nella maggior parte dei fluidi biologici (che mostrano un pH>5), queste fluttuazioni non aboliscono il potenziale di membrana e le EV continuano a mantenere un range di carica negativa superficiale. Direttamente quindi nei biofluidi in cui si trovano, le EV eterogenee in dimensione possono essere catturate sfruttando il loro potenziale negativo e rilasciate poi in soluzione.
La novità principale che determina la specificità di questo approccio risiede nella eluizione (rilascio) delle EV. Infatti, diverse molecole biologiche tra cui proteine, DNA e RNA possono essere catturate. La fase di eluizione è stata però disegnata su misura per le EV mediante una soluzione elettrolitica che consente di raccogliere le EV in una soluzione fisiologica, preservando l’integrità originale. Questo sistema è rapido (si isolano le EV in meno di un’ora), molto efficiente e scalabile (si recupera il 98% delle particelle in volumi di biofluido che possono variare da pochi microlitri a litri) e riproducibile (il coefficiente di variazione nel recovery è inferiore all’8%). Inoltre è un metodo estremamente versatile: le EV in soluzione fisiologica iniettabile sono analizzabili con dispositivi di analisi e/o diagnostica molecolare tradizionale e di next-generation.
Questa invenzione, in funzione di possibile sfruttamento industriale, risolve diverse sfide in uno scenario in cui sono stati definiti i limiti attuali legati all’isolamento delle vescicole extracellulari; può trovare applicazione in laboratori di ricerca biomedici e diagnostici, aziende farmaceutiche, ospedali, centri di ricerca e sviluppo. La qualità delle nanoparticelle ottenute con questo sistema, come singole EV in una soluzione a pH fisiologico, consente per la prima volta di applicare direttamente le nanoparticelle a test basati su tecnologie ultrasensibili già disponibili sul mercato, quali amplified luminescent proximity homogeneous assay (alpha), droplet digital PCR (ddPCR) e PCR quantitativa, immunocattura, che risultano estremamente sensibili nel rilevare la presenza di mutazioni genetiche o biomarcatori specifici di malattia. Il metodo così disegnato è stato realizzato in forma di prototipo (kit) contenente i reagenti necessari per effettuare l’isolamento delle EV da materiale biologico. Questo sistema è anche adattabile a piattaforme high-throughput che consentono un’analisi contemporanea di nanoparticelle derivanti da migliaia di campioni biologici di partenza, rendendo possibile un alto livello di automazione per l’analisi delle EV.
New method of laboratory analysis patented
A CIBIO invention to isolate extracellular vesicles from biological samples
In December 2017 the University of Trento filed a patent application for the invention of a fast, efficient and inexpensive procedure for the isolation of extracellular vesicles (EVs) from biological fluids such as blood, urine and saliva. The patent is the result of an interdisciplinary study at CIBIO on frontier research topics regarding the application of nanoparticles in biomedicine. The invention was developed in the Laboratory of Biotechnology and Nanomedicine, together with the Laboratory of Translational Genomics (Principal Investigator Alessandro Quattrone) and the Laboratory of Genomic Screening (Principal Investigator Alessandro Provenzani). Based on the study of the nanoparticles that are secreted by both healthy and diseased cells, the procedure offers a number of benefits, including purification of intact nanoparticles while maintaining their original dispersity and stability, and integration with ultrasensitive systems for detecting specific biomarkers for diseases (proteins and nucleic acids).
The invention for this patent is based on an innovative principle that is exploited for the isolation of the extracellular vesicles (EVs). EVs are spherical particles secreted by cells and made up of a double-layered lipid membrane, like the membranes of a cell. EVs are released in abundance into biological fluids and have dimensions that vary widely. They are divided principally into exosomes (very small vesicles) and microvesicles (larger vesicles). In both cases the diameter is in the order of nanometers (a billionth of a meter), 100-1000 times smaller than the diameter of a cell.The scientific community recognises EVs as a promising new diagnostic tool for liquid biopsies (e.g. blood, urine or saliva) in order to detect the first traces of disease at a very high resolution and at a very early stage. Research on EVs and their applications has, however, been limited by the expensive isolation procedures, which did not allow purification without a large number of ‘biological contaminants’, such as proteins and protein-nucleic acid complexes, which have very similar dimensions and make tests non-reproducible. Our method aims to overcome these problems.
The idea underlying this new method is very simple: just as cells bounded by a lipid membrane have a surface potential difference (the presence of a charge), EVs have a net negative charge. Physics teaches us that this potential fluctuates depending on the pH, the temperature and the salts dissolved in the various fluids. However, in most biological fluids (with a pH>5), these fluctuations do not abolish the membrane potential and the EVs maintain a negative surface charge. So directly in the biofluids containing them, EVs of heterogeneous dimensions can be captured by exploiting their negative potential, and then released into a solution.
The principal novelty of this approach is in the elution (release) of the EVs. While a variety of biological molecules can be captured, including proteins, DNA and RNA, the elution phase was designed specifically for EVs, using an electrolytic solution that allows us to collect the EVs in a physiological solution, preserving their integrity. This system is rapid (EVs are isolated in less than an hour), very efficient and scalable (98% of the particles are recovered from biofluid volumes varying from a few microlitres to litres) and reproducible (the coefficient of variation in the recovery is less than 8%). It is also an extremely versatile method: EVs in an injectable physiological solution can be analysed with both traditional and next-generation analysis and/or molecular diagnostics tools.
This invention, with its potential for industrial use, resolves a range of challenges resulting from current limits in the isolation of extracellular vesicles. Possible applications are in biomedical research and diagnostics, pharmaceutical companies, hospitals, and research and development centres. The quality of the nanoparticles obtained with this system, such as single EVs in a physiological solution, allows us for the first time to directly apply these nanoparticles to tests based on ultrasensitive technologies already on the market, such as amplified luminescent proximity homogeneous assays (alpha), droplet digital PCR (ddPCR) and quantitative PCR, and immunocapture, which are extremely sensitive in the detection of genetic mutations or specific disease biomarkers. The method has been realised in the form of a prototype (a kit) containing the reagents necessary to isolate the EVs from biological material. This system is also adaptable to high-throughput platforms that can simultaneously analyse nanoparticles from thousands of biological samples, making a high level of automation possible for the analysis of EVs.